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Les enzymes protéolytiques utilisées lors d’investigations sérologiques des groupes sanguins

Un blogue d’Eric Ching

Questions:
  • Quelles sont les enzymes protéolytiques couramment utilisées dans l’identification des anticorps?
  • Quelles sont les enzymes protéolytiques moins communément utilisées dans les laboratoires de référence?
  • Quels antigènes de groupe sanguin sont sensibles au traitement enzymatique?
  • Quels anticorps sont habituellement rehaussés par les enzymes?
  • Comment améliorent-elles l’absorption des anticorps?
  • Comment une enzyme abolit-elle la polyagglutination?
  • Pourquoi les globules rouges traités aux enzymes ne sont-ils plus utilisés dans le dépistage systématique des anticorps?
  • Quelle est la différence entre une technique à une étape et une technique à deux étapes?
  • Pourquoi un traitement excessif des globules rouges par des enzymes protéolytiques causerait-il une auto-agglutination?
  • Outre l’amélioration de la réactivité des anticorps et la dénaturation des antigènes érythrocytaires, y a-t-il d’autres applications pour les enzymes?
  • Devrions-nous préparer les enzymes protéolytiques « à l’interne »?
  • Le test indirect à l'antiglobuline (TIA) enzymatique doit-il être lu macroscopiquement?
Réponses:

Quelles sont les enzymes protéolytiques couramment  utilisées dans l’identification des anticorps?
La ficine, la papaïne et la broméline sont couramment utilisées. La ficine et la papaïne sont extraites de figue verte adulte mais immature et de latex de papaye respectivement tandis que la broméline est préparée à partir de noyaux d’ananas écrasés.  La matière première est séchée et commercialisée sous forme de poudre et peut contenir d’autres enzymes.

Quelles sont les enzymes protéolytiques moins communément  utilisées dans les laboratoires de référence ? 
Neuraminidase aussi appelée sialidase (Vibrio cholerae), pronase (Streptomyces griseus), trypsine (estomac porcin), chymotrypsine (pancréas bovin/porcin) et autres.

Quels antigènes de groupe sanguin sont sensibles au traitement à la papaïne/ficine?
M,N,S,Fya,Fyb, Ena(TS, FS), Pr, Cha, Rg, JMH, Yta, T, Tn, Mg, Mia/Vw, Cla, Jea, Nya, Lu8,Lu14, Ina, Inb, Xga et autres

Quels anticorps sont habituellement rehaussés par la papaïne et ficine?
La force de réaction des anticorps classés dans les systèmes sanguins suivants est généralement rehaussée lorsque des globules rouges traités à la papaïne et à la ficine sont utilisés:
ABO, Hh, Rh, Lewis, Kidd, Ii, P, Globoside, Colton et Dombrock
 
Comment améliorent-ils l’absorption des anticorps?
Les enzymes protéolytiques sont des « bûcherons sérologiques » qui coupent les liaisons peptidiques spécifiques des glycoprotéines transmembranaires où résident certains antigènes de groupe sanguin. Notamment les glycophorines (je les appelle les arbres) qui abritent les antigènes du groupe sanguin MNS. Ces glycoprotéines hydrophiles attirent les molécules d’eau pour former un bouclier d’hydratation pour empêcher l’anticorps d’interagir avec les antigènes hydrophobes plus près de la surface des cellules rouges dans le premier stade d’interactions anticorps-antigènes appelé sensibilisation.  De plus, les résidus d’acide sialique alias acide neuraminique N-acétyle (NANA) (je les appelle feuilles) attachés aux glycophorines sont également retirés pour permettre aux globules rouges de se rapprocher dans la deuxième étape de l’interaction cellule-cellule. Ce phénomène peut être démontré par l’utilisation d’IgG pur anti-D qui peut agglutiner directement les globules rouges Rh+ traités aux enzymes en suspension dans la solution saline.
 
Un autre point d’intérêt : l’amplitude thermique de l’agglutinine réactive à froid peut être élargie par les globules rouges traités aux enzymes en raison de l’absorption accrue des anticorps et de l’agglutinabilité accrue.

Comment une enzyme abolit-elle la polyagglutination?
La polyagglutination est un phénomène observé lorsque les globules rouges du patient sont agglutinés par presque tous les sérums humains normaux. Elle est le résultat d’une enzyme neuraminidase virale ou bactérienne (sialidase) qui expose les antigènes cachés (T étant le plus commun) qui sont facilement reconnus par les anticorps présents dans les sérums humains normaux. Ces antigènes cryptés ou cachés (tétrasaccharides ou quatre résidus de sucre composés de 2 acides sialiques, galactose et galactosamine N-acétyle que j’appelle feuilles, sont attachés aux glycophorines) sont détruits par les enzymes comme la ficine ou la papaïne car celles-ci peuvent couper les glycophorines et ainsi abolir la polyagglutination. L’utilisation de la neuraminidase (sialidase) peut faire le même travail et cible juste les feuilles.
 
Pourquoi les globules rouges traités aux enzymes ne sont-ils plus utilisés dans le dépistage des anticorps?
Avant le milieu des années 70, de nombreuses banques de sang utilisaient des globules rouges traités aux enzymes ainsi que des globules rouges non traités pour le dépistage des anticorps de routine afin d’augmenter la sensibilité. Toutefois, en raison de la spécificité réduite due aux autoanticorps réagissant à froid et à chaud et de la sensibilité accrue offerte par l’utilisation du LISS et du PEG, le « dépistage enzymatique » a finalement été abandonné. Cependant, la technique enzymatique est toujours très utile pour résoudre les cas complexes de mélange d’anticorps.
 
Quelle est la différence entre une technique à une étape et une technique à deux étapes?
La technique à une étape consiste en l’ajout séquentiel de sérum, de cellules et d’enzymes avant l’incubation.

La méthode en deux étapes consiste à traiter les globules rouges par enzyme dans un premier temps et suite aux lavages des globules rouges traités, le sérum ou le plasma est ajouté. C’est la méthode privilégiée car il y a une chance qu’un anticorps soit déjà lié à l’antigène avant que la réaction enzymatique commence ce qui, en théorie, peut réduire l’efficacité. Les réactifs cellulaires commerciaux traités aux enzymes utilisent la technique en deux étapes.

Pourquoi un traitement excessif des globules rouges par des enzymes protéolytiques provoquerait-il une auto-agglutination?
Le traitement excessif des globules rouges par une enzyme protéolytique fend les résidus d’acide sialique présents sur la glycoprotéine membranaire et les glycolipides provoquant l’auto-agglutination. Au microscope électronique, les globules rouges traités à la papaïne sont déformés et la surface apparait « filamenteuse et ondulée ».
 
En général, les enzymes protéolytiques peuvent modifier la membrane des cellules rouges à différents niveaux d’intensité :
  1. Amélioration de la réactivité de certains anticorps
  2. Dénaturation de certains antigènes
  3. Auto-agglutination avec du sérum inerte
  4. Auto-agglutination avec la saline
  5. Lyse
Outre l’amélioration de la réactivité des anticorps et la dénaturation des antigènes érythrocytaires, existe-t-il d’autres applications pour les enzymes ?
Les globules rouges traités aux enzymes sont utiles dans les situations suivantes :
  1. Les globules rouges traités aux enzymes sont plus susceptibles d’être hémolysés par un auto-anti-I pathologique à 20°C
  2. Les autoanticorps réactifs faiblement à chaud peuvent imiter les alloanticorps lors du TIA, la panagglutination observée avec un panel enzymatique peut révéler leurs interférences.
  3. Les globules rouges autologues traités aux enzymes sont plus efficaces pour éliminer la réactivité causée par des autoanticorps réagissant à froid et à chaud.
  4. Diagnostic de la polyagglutination.
 Note:
  • Association possible d’autoanticorps contre la papaïne chez les enfants atteints de scoliose - observation personnelle non publiée, aucune application utile.
  • Dans les années 1970, où l’on utilisait régulièrement des globules rouges papainisés et non traités pour dépister les anticorps, la plupart des « auto-papaïne » identifiés avaient été prélevés à partir d’échantillons préopératoires à l’hôpital local pour enfants. Je me demande si des collègues de ma génération ont observé la même chose ?
Devrions-nous préparer des enzymes protéolytiques « à l’interne »?
Compte tenu des exigences liées aux « Bonnes pratiques de fabrication (BPF) », les laboratoires cliniques devraient éviter autant que possible de préparer des réactifs maison. Les hématies-test traitées à la ficine et la papaïne sont disponibles commercialement. Cependant, si le budget est serré, il est possible d’acheter de la papaïne lyophilisée, reconstituer à 2 ml à une solution de 1 %, q à 20 ml avec PBS @ pH7.3 et préparer 10 aliquotes de 2 ml. Ils peuvent être stockés à -30°C pour une durée maximale de 12 mois. Le contrôle de qualité interne et la validation doivent être documentés.
 
Le TIA à l’aide d’hématies traitées aux enzymes, doit-il être lu macroscopiquement?
Bien qu’il soit conseillé de lire le résultat au TIA enzymatique macroscopiquement pour les tests de routine, il peut être utile de déchiffrer des informations précieuses lorsque la lecture macroscopique est négative mais la lecture microscopique est positive avec un profil de réaction spécifique. Par exemple, si seules les cellules Jk(a+b-) sont positives, cela peut indiquer une phase précoce d’une réaction transfusionnelle hémolytique  retardée dans laquelle la concentration  d’anticorps commence à augmenter. Un nouvel échantillon prélevé le lendemain matin peut donner un profil de réaction plus clair.  Un autre truc » pour déceler un possible anti-Jka réagissant faiblement est l’utilisation de la papaïne 4:1 ou d’effectuer un TIA à l’aide d’hématies ficinées suivi par l’ajout d’AHG polyspécifique dans l’espoir que l’anti-complément aide. Un échantillon de sérum frais doit être utilisé dans ce cas.
 
Autres lectures suggérées
  • Utilisation d’enzymes peu communes pour différencier les alloanticorps rares : The Blood Group Antigen Facts Book de Marion Reid et Christine Lomas-Francis
  • Uniformisation des procédures enzymatiques : manuel technique de l’AABB
  • Évaluation des globules rouges traités aux enzymes : manuel technique de l’AABB
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