Conseils techniques : Titrage - applications sérologiques et cliniques

Un blogue d’Eric Ching :
 
Bref aperçu

Veuillez lire la procédure de titrage dans le manuel technique de l’AABB si vous ne la connaissez pas.

Le titrage est une méthode semi-quantitative car la procédure comporte de nombreuses variables

1. La taille de la goutte peut être influencée par :
   • angle de pipette
   • variation de la taille de l’alésage des pipettes jetables
   • viscosité du spécimen (plasma/sérum) si des pipettes en verre jetables sont encore utilisées (peut-être toujours le cas dans les pays en développement)!
2. Variations des cellules indicatrices :
   • dosage
   • âge
   • Concentration de la suspension cellulaire (2 % versus 4 %)
3. Subjectivité du point final :
   • durée et température d’incubation
   • force d’agitation avant la lecture
   • agglutination macroscopique (tout le monde n’a une vision 20/20!)

Afin de réduire au minimum les variations et d’éviter la contamination entre 2 dilutions, une dilution principale peut être préparée à l’aide d’une pipette électronique étalonnée ou d’embouts jetables de pipette de précision. L’automatisation peut potentiellement augmenter la précision.

Dilutions en série

Ratio plasma/diluant salin : 2 fois : 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 …. 1/512 ou 10 fois : 1/1,1/10, 1/100…

Une dilution sériée à la demie est généralement utilisée.
 
Pour titrer une agglutinine froide réagissant fortement, je préfère faire une dilution sériée au dixième dix fois :

1. À l’aide d’une pipette de précision, pipetter 0,1 ml d’échantillon dans, 50 ml de saline dans un cylindre de mesure de 100 ml et mélanger soigneusement.
2. Préparer une dilution mère en utilisant 1 ml de solution saline comme diluant. 1/500, 1/1 000,1/2 000,1/4 000 10 tubes à 1/256 000

Le titre correspond à l’inverse de la dilution la plus élevés ayant obtenu une lecture macroscopique de 1+ 

Rapport : Titre 16, ce qui signifie que le sérum ou le plasma du patient dilué à 1 sur 16 (V/V) donne une lecture macroscopique de 1 + car le titre est défini comme la réciproque de la dilution la plus élevée donnant un résultat positif au test.

Notes:

1. Un sérum bovin albumineux (SBA) à 6% ou du LISS ne doivent pas être utilisé comme diluant, même si ces réactifs sont utilisés pour l’analyse des anticorps. Les milieux avec potentialisateurs augmenteront la réactivité de la réaction d’anticorps réagissant à chaud et auront un effet encore plus marqué sur   les agglutinines froides réagissant à froid. 
2. Si une pipette jetable en verre est utilisée, marquer la pointe pour qu’elle contienne 4 gouttes et deux gouttes pour être uniforme.
3. Plus le volume de transfert est élevé, meilleure sera la reproductibilité. Je préfère 0,5 ml, sauf si la disponibilité de l’échantillon est limitée.
4. Un SBA de 0,5 % dans la saline (v/v) n’affectera pas le résultat, mais aidera à stabiliser les anticorps dans les solutions plus faibles. (Manuel technique de la Croix-Rouge canadienne. 7e éd. 1972.)
5. Dans le même manuel, le mélange du diluant et de l’échantillon doit être fait au moins six fois!
6. L’uniformité est essentielle à la fiabilité des résultats du titrage :
   • formation continue du personnel sur l’agitation et les forces de réactions 
   • utilisation de cellules indicatrices du même phénotype, etc.

Applications cliniques

1. Pour surveiller le niveau d’anticorps prénataux : dans la plupart des établissements avec service prénatal, un titre 16 ou 32 est considéré comme l’indicateur pour passer à l’échographie Doppler ou à l’amniocentèse pour évaluer la gravité.
2. Aider à diagnostiquer le syndrome d’agglutinine froides qui est associé à une pneumonie atypique et à des troubles lymphoprolifératifs.
3. Déterminer le taux d’isohémagglutinines dans les greffes de cellules souches et d’organes chez les nouveau-nés.
4. Dans les anémies hémolytiques auto-immunes (AHAI), le titrage peut être utilisé pour déterminer diverses spécificités des agglutinines froides dans le syndrome d’agglutinine froide ou la « spécificité Rh » dans l’AHAI à anticorps chauds. Ces déterminations sont généralement d’intérêt académique.

 Applications sérologiques

1. Pour identifier, dans la plupart des cas, les anticorps à concentration(s) élevée(s), lorsqu’ils sont présents dans un mélange :
   • Titrez le plasma du patient en utilisant différents globules rouges du panel réactif, ce qui est particulièrement utile lorsque toutes les cellules du panel sont réactives à 4+ !
   • Diluez le sérum du patient en conséquence.
   • Effectuer l’identification des anticorps sur le sérum dilué.
   • Panagglutination uniforme indique un anticorps unique dirigé contre un antigène à incidence élevée. Profil de réaction distinct peut révéler une ou plusieurs spécificités.
   • Dans le cas d’un mélange d’anticorps, les anticorps les plus faibles peuvent être identifiés en utilisant des globules rouges n’exprimant pas l’antigène(s) correspondant aux anticorps réagissant le plus fortement. Des milieux avec potentialisateurs et l’utilisation d’enzymes ou d’agents chimiques connus pour inhiber ou détruire certains antigènes à incidence élevée peuvent aider à l’identification. Par exemple, en présence d’une combinaison d’anti-k et d’anti-c, le traitement des globules rouges au ZZAP ou au  DTT peut être utilisé pour empêcher l’anti-k de réagir et ainsi de révéler l’anti-c caché.

2. Détecter la présence d’anticorps soi-disant à titre élevé et de faible avidité (TEFA/HTLA), comme les anticorps dirigés contre les antigènes, Bg, York, McCoy, JMH, etc.
3. Détecter la présence d’antigènes érythrocytaires solubles comme l’ABH, Lewis et Rogers et Chido dans des études d’inhibition.
4. Comparer l’expression d’antigènes à l’aide d’un anticorps connu pour la stabilité à l’entreposage et la détermination du dosage.
5. Révéler des alloanticorps plus forts en présence d’un autoanticorps plus faible.
6. Pour différencier les IgG ou les IgM ou le mélange des deux dans l’étude d’inhibition du sérum au DTT.

Interprétations

A.  Un échantillon prénatal d’anti-D, titre 128 :
 

1	2	4	8	16	32	64	128	256	512
1	1	1	1	1	1	1	1	0	0

B.  Tests de neutralisation d’un anticorps présentant des caractéristiques HTLA   (f = faible)
 

Titre	1	2	4	8	16	32
Ch- plasma	f	f	f	f	f	-
Rg- plasma	-	-	-	-	-	-
Pool de plasmas	-	-	-	-	-	-
Contrôle saline	f	f	f	f	f	-

 
Le plasma connu négatif pour la substance Chido n’a pas neutralisé l’anticorps plasmatique du patient, par conséquent, le patient a un anti-Chido.  Le plasma Rg- et le plasma poolé contiennent de la substance Chido, donc l’anti-Chido du patient a été neutralisé. Le contrôle de saline indique que l’anti-Chido du patient n’a pas été suffisamment dilué pour provoquer la réaction négative.

C.  Détermination de la classe d’anticorps dans le sérum du patient (SP); DTT = dithiothreitol à 0,1 M 
  

Titre	1	2	4	8	16	Interprétation
SP+DTT	3+	2+	1+	1+	0
SP+Saline	3+	2+	1+	1+	0	IgG
SP+DTT	0	0	0	0	0
SP+Saline	3+	2+	1+	1+	0	IgM
SP+DTT	2+	1+	0	0	0
SP+Saline	3+	2+	1+	1+	0	IgG+IgM

 








D.  Essai d’inhibition de la salive pour déterminer l’état des sécréteurs d’un sérum de groupe B dilué 1 sur 32 comme dilution initiale 
 

Salive / Titre	32	64	128	256	512
Sécréteur de A1	1	1	1	1	1
Sécréteur de A2	f	1	1	1	1
Non-sécréteur de A1	1	1	1	f	1

 
Notes:

• Les antisérums monoclonaux ne peuvent pas être utilisés pour le test d’inhibition de la salive
• Comme les sécréteurs A2 ont moins de A dans la salive que le sécréteur A1

E. Titre faussement élevé en raison d’antigènes TEFA sur les cellules indicatrices
                

Titre	1	2	4	8	16	32	64	128	256
D+ Bga+	3+	2+	1+	1+	1+	1+	1+	f	0
D+ Bga-	3+	2+	1+	0	0	0	0	0	0

Une prise en charge prénatale inutile peut être évitée si l’on reconnaît une telle interférence !
 
F    Titrage d’une agglutinine froide montrant un effet de prozone (excès d’anticorps)
 

Titre	1	2	4	8	16	32	64	128	256
I+	0	1+	2+	2+	3+	4+	4+	4+	3+

 
G. « Anti-e relative » dans l’AHAI à anticorps chauds
 

Titre	1	2	4	8	16	32	64	128	256
R1R1 (DCe/DCe)	4+	4+	4+	4+	3+	2+	1+	1+	0
R2R2 (DcE/DcE)	2+	2+	1+	0	0	0	0	0	0
rr (ce/ce)	4+	4+	4+	3+	3+	2+	1+	0	0

 
 
Investigations possibles pour nos collègues curieux ou comme projets étudiants :

1. Dans les cas d’AHAI à anticorps chauds, les patients reçoivent généralement une thérapie stéroïdienne au lieu de la transfusion; la gestion clinique implique des décomptes de réticulocytes et des déterminations d’hémoglobine répétées pour évaluer si le patient répond au traitement dans 4-7 jours. Si le test direct à l’antiglobuline (TDA) du patient est de 4+ lors de l’initiation du traitement, je me demande s’il possible de titrer l’anti-IgG avec les globules rouges du patient pour voir s’il y a une corrélation entre le titre et le décompte de réticulocytes /hémoglobine.
2. Il est possible d’acheter un anti-D avec la concentration d’anticorps en microgramme par ml standardisée. Demander à la SCS régionale de fournir 10 à 20 échantillons d’anti-D tous au titre 16 pour établir une gamme de concentrations d’anti-D en ug/ml. Ensuite, mettre en place une étude pour voir si les échantillons prénataux peuvent être quantifiés à l’aide de titrage, de tests enzymatiques à l’antiglobuline ou de tests par cytométrie de flux pour déterminer quel essai correspond le mieux aux résultats obtenus par technologie d’échographie dans les soins prénataux.

 
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